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            单细胞测序前的3大关键问题,您都处理对了吗?

            发布时间:2020/1/2点击次数:29

            在无数实战经验中,制备高质量的单细胞悬液被公认为重中之重。实验过程中,如单细胞活性不高,细胞数过低,以及污染和杂质等问题,都会影响到有效单细胞数的产出、单细胞核酸的质量等,最终得到的单细胞数据分析及统计结果不可信。

            那么,组织如何解离?需要选什么酶?还需要注意什么?远慕生物根据相关权威文献整理了单细胞悬液制备的方法和小贴士,让我们一起来解决单细胞研究方案中的拦路虎。

            实体组织解离关键——酶的合理选择

            实体组织解离两大步骤,包含机械分离和酶消化处理。

            首先,组织需要通过物理切割或刀片切碎,然后通过酶消化来分离细胞。特定的组织消化酶及消化时间不同,相关建议可参考如下表格:人和小鼠的部分组织类型——肝脏、肺、皮肤、脾脏、消化道、胰腺、肾脏、视网膜等。

            表1 人鼠各类型组织酶解单细胞悬液方法总结[1]

            除此之外,常用酶的类型还包括:Accutase™、弹性蛋白酶和胶原酶,以及商业酶混合物,如 TrypLE Express 和 Liberase Blendzyme 等。

            血液处理成关键——离心稳定操作[1]

            样品经过密度离心(例如使用Ficoll-Paque或Histopaque-1077技术),可以直接用于外周血单核细胞(PBMC)捕获[1]。

            建议不少于5mL EDTA 抗凝血,且不要使用肝素抗凝管收集血液;同时注意在合适转数离心操作后,管中内容物分为三层,上层为血浆(内含细胞碎片),中间层为分层液,底层为红细胞,在上、中层液体界面处可见到乳白色混浊的单核细胞层( 白膜层,。。此时,需使用无菌吸管小心沿离心管壁周缘吸取界面层单核细胞后,再加入HBSS /PBS重悬。更多注意事项请参见华大科技单细胞送样建议。

            单细胞悬液制备的8条建议[1]

            1. 建议采用无菌样品处理方式,包括使用不含核酸酶的试剂和耗材。

            2. 为降低对细胞的损伤,移液和离心应保持在最低程度。在一定的离心速度、时间和温度下,细胞浓度和大小直接影响制备的效率。

            3. 在进行细胞清洗和重悬过程中,使用具有合适大小的器皿,避免高浓度导致细胞集聚和结块,请注意选择。

            4. 应使用适当大小的细胞过滤器过滤悬浮液,孔径大于细胞直径,以去除团块和碎片。

            5. 细胞清洗和复苏,推荐使用含牛血清的磷酸盐缓冲盐水(不含钙和镁),减少细胞损失和聚集的白蛋白。

            6. 细胞裂解升高可导致细胞团块形成,在细胞分离过程中,DNase I可减少细胞团块形成。

            7. 细胞团块会导致自动细胞计数器低估单个细胞的有效浓度,因此制备后应尽快处理悬浮液,最好在30分钟内处理。

            8. 总之,在单细胞制备中,尽可能减少细胞聚集物、死亡细胞、非细胞核酸和逆转录(RT)抑制剂是非常重要的。为了在最大限度地提高不同细胞类型的纯度和无偏回收率的同时,最小化这些污染物,可能需要应用优化,例如,调整洗涤步骤的数量、洗涤溶液的组成、离心条件和/或过滤器类型。

             

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